CRISPR のロックを解除するための DNA アセンブリ キット

2023年8月30日の特集

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Thamarasee Jeewandara、Phys.org 著

クラスター化された規則的に間隔をあけられた短い回文リピート (CRISPR) および Crispr 関連タンパク質 9 (CRISPR/Cas9) は、現在、微生物細胞を操作するためのよく知られた革新的な方法です。

CRISPR の重要な利点は、染色体への組み込みを促進してマーカーフリー DNA の構築を可能にする株設計にあります。 これらの編集システムは非常に有益です。 ただし、その組み立ては完全に簡単ではなく、使用や応用が妨げられる可能性があります。

Nature Communications Biology の新しいレポートで、Tigran V. Yuzbashev と研究チームは、CRISPR 技術へのアクセスと実装を容易にするために設計された既存の Cas9 ツールキットの限界を特定しました。 彼らは、確立された 3 つの異なる方法について議論し、それらを組み合わせて、CRISPR/Cas9 を使用した効率的な代謝工学のための包括的なツールキットを形成しました。

研究室でホモゲンチジン酸を構築するための 137 個のプロモーターのライブラリーを生成および特性評価するための 147 個のプラスミドで構成される単一のツールキット。

CRISPR/Cas9 システムは、迅速、正確、傷跡のないゲノム修飾を行うことができ、生物生産のための微生物株を設計するための大きな範囲を提供します。 たとえば、酵母の代謝工学は、化学物質、燃料、食品、医薬品の持続的生産のための生物学工学において急速に成長している分野を提供します。

酵母は真核細胞と同様に代謝能力を備えているため、操作や大規模培養が容易です。 その結果、生物工学者は酵母用の CRISPR システムを設計および開発しました。

CRISPR は効率が高いため、マーカーを使用しないゲノム修飾が可能です。 この研究において、ユズバシェフ氏は酵母工学のための CRISPR/Cas9 システムの 3 つの改善点を特定することで、菌株の最適化を確実にし、代謝工学プロジェクトを促進しました。 この方法には、1) マーカー修飾とマーカーなし修飾間の簡単な交換、2) 異なる組み込み位置を決定するための相同性アームの迅速な交換、および 3) gRNA をクローニングする簡単な方法が含まれます。

CRISPR ベースのマーカーフリー組み込みを可能にするために、研究チームは、細胞増殖を達成するために修復する必要がある Cas9 によって誘導される二本鎖切断を選択しました。 科学者らは、相同組換えまたは非相同末端結合（NHEJ）によって統合されずに統合されたテンプレートまたはドナーを使用することで、これを可能にしました。 非相同末端結合のプロセスは、パン酵母 Saccharomyces cerevisiae を含むほとんどの真菌種で観察されます。

研究チームは、NHEJ機構が優勢な種において、NHEJ遺伝子を欠失させることで相同組換えを強化した。 マーカーを使用しない方法が成功しなかった場合、科学者らはその後、CRISPR-Cas9 を利用した統合を改善して、マーカーベースの統合に簡単に戻すことを目指しています。

Cas9を利用した組み込みには通常、2つの相同性アームが隣接する統合カセットからなるドナーテンプレートが必要です。 研究チームは、CRISPR/Cas9の理想的な統合には、簡略化されたゴールデンゲートアセンブリ反応を介して、事前に評価されたCas9ドナー構築物上の相同性アームを交換する必要があると理論立てた。

さらに、プロモーターは、フラックスを目的の生成物に向け直すための代謝工学プロジェクトにとって重要な要素です。 ユズバシェフら。 は、産業用酵母ヤロウィア リポリティカを使用して、遺伝子編集と DNA アセンブリ戦略を組み合わせた代謝工学ツールキットを開発して、高効率と多用途性を実現しました。